Plusieurs ATPases ParA/MinD coordonnent le positionnement de cargaisons disparates dans une cellule bactérienne

Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 3255 (2023) Citer cet article

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Chez les eucaryotes, les protéines motrices linéaires régissent le transport et l'organisation intracellulaires. Chez les bactéries, où les moteurs linéaires impliqués dans la régulation spatiale sont absents, la famille d'ATPases ParA/MinD organise un éventail de cargaisons cellulaires génétiques et protéiques. Le positionnement de ces cargaisons a été étudié de manière indépendante à des degrés divers chez plusieurs espèces bactériennes. Cependant, on ne sait toujours pas comment plusieurs ATPases ParA/MinD peuvent coordonner le positionnement de diverses cargaisons dans la même cellule. Ici, nous constatons que plus d'un tiers des génomes bactériens séquencés codent plusieurs ATPases ParA/MinD. Nous identifions un organisme (Halothiobacillus neapolitanus) avec sept ATPases ParA/MinD, démontrons que cinq d'entre elles sont chacune dédiées à la régulation spatiale d'une seule cargaison cellulaire, et définissons des déterminants potentiels de spécificité pour chaque système. De plus, nous montrons comment ces réactions de positionnement peuvent s'influencer mutuellement, soulignant l'importance de comprendre comment le trafic d'organites, la ségrégation des chromosomes et la division cellulaire sont coordonnés dans les cellules bactériennes. Ensemble, nos données montrent comment plusieurs ATPases ParA/MinD coexistent et fonctionnent pour positionner un ensemble diversifié de cargaisons fondamentales dans la même cellule bactérienne.

Les filaments d'actine, les microtubules et les protéines motrices linéaires qui les parcourent sont bien connus pour leur organisation spatiale dans les cellules eucaryotes. Chez les bactéries, cependant, où les moteurs linéaires impliqués dans le positionnement sont absents, une famille répandue d'ATPases ParA/MinD (A/D) organise spatialement des plasmides, des chromosomes et un éventail d'organites à base de protéines, dont beaucoup sont fondamentales pour la survie et la pathogenèse des cellules. De loin, les deux ATPases les mieux étudiées, et homonyme de la famille, sont ParA impliquée dans la partition plasmidique et la ségrégation chromosomique1,2, et MinD impliquée dans le positionnement des divisions3. Moins étudiée est la liste croissante des ATPases A/D, répandues parmi les procaryotes, impliquées dans la régulation spatiale de divers organites à base de protéines, tels que les microcompartiments bactériens (BMC)4,5, les flagelles6,7, les clusters de chimiotaxie8,9 et la machinerie de conjugaison10.

Malgré la diversité des cargaisons, les ATPases A/D partagent un certain nombre de caractéristiques : (i) toutes forment des dimères en sandwich d'ATP11, (ii) la dimérisation forme une interface pour lier une matrice de positionnement - le nucléoïde pour les ATPases de type ParA12,13 ou la membrane interne pour les ATPases de type MinD14,15, et (iii) la dimérisation forme également un site de liaison pour une protéine partenaire apparentée qui relie une ATPase à sa cargaison et stimule sa sortie de la matrice de positionnement. Par exemple, dans la ségrégation des chromosomes, le partenaire ParA est ParB, qui se charge sur un site de type centromère, appelé parS, pour former un complexe massif sur le chromosome près de l'origine de la réplication (OriC)2. Ce complexe ParB-parS stimule localement l'activité ParA ATPase et la libération de nucléoïdes, ce qui génère des gradients de ParA sur le nucléoïde. La ségrégation des chromosomes frères s'ensuit lorsque le complexe ParB-parS poursuit les gradients ParA liés aux nucléoïdes dans des directions opposées16. Par conséquent, contrairement à l'appareil à fuseau mitotique utilisé dans la ségrégation des chromosomes eucaryotes, les procaryotes utilisent un mode d'organisation spatiale fondamentalement différent : les ATPases A/D font des ondes sur les surfaces biologiques pour positionner leurs cargaisons respectives.

La ségrégation des chromosomes, le positionnement de la division cellulaire et les réactions de trafic d'organites ont été étudiés indépendamment à des degrés divers chez plusieurs procaryotes. Pourtant, on ne sait toujours pas combien d'ATPases A/D peuvent être codées dans une seule bactérie pour positionner plusieurs cargaisons disparates, ou comment les bactéries coordonnent spatio-temporellement le positionnement d'un ensemble aussi diversifié de cargaisons fondamentales dans la même cellule. De plus, les variations mécanistes et les déterminants de la spécificité qui régissent le positionnement d'un ensemble aussi diversifié de cargaisons cellulaires restent flous. En effet, les réactions de positionnement basées sur A/D sont généralement étudiées indépendamment les unes des autres et dans des bactéries modèles avec peu d'ATPases A/D.

Ici, nous constatons qu'un tiers des bactéries séquencées codent pour plusieurs ATPases A/D. Parmi ces bactéries, nous avons identifié Halothiobacillus neapolitanus (H. neapolitanus ci-après), avec sept ATPases A/D putatives. L'analyse de voisinage des gènes A/D ATPase chez H. neapolitanus implique plusieurs cargaisons putatives. Nous utilisons la génétique et la biologie cellulaire pour attribuer cinq des ATPases A/D de H. neapolitanus à leurs cargaisons. Nos résultats montrent que chaque ATPase est directement dédiée au positionnement et à l'héritage fidèle d'un type de cargaison spécifique. La traçabilité et le nombre d'ATPases A/D ont fait de H. neapolitanus un outil précieux pour étudier également comment les bactéries coordonnent les processus de ségrégation des chromosomes et de division cellulaire avec le trafic d'organelles - une question bien étudiée dans les cellules eucaryotes qui reste sans réponse chez les procaryotes. Nous montrons comment la suppression d'une ATPase A/D peut avoir des effets indirects sur l'héritage de cargaisons disparates positionnées par d'autres ATPases A/D via des défauts de réplication de l'ADN, de ségrégation chromosomique et/ou de division cellulaire. Nous fournissons également des preuves que le positionnement des flagelles influence la régulation spatiale des grappes de chimiotaxie. Enfin, nous identifions des déterminants putatifs de séquence et de structure qui lient de manière unique chaque A/D ATPase à une cargaison spécifique, permettant finalement à ces ATPases apparentées de coexister et de fonctionner dans la même cellule. Ensemble, notre étude sonde les points communs et les variations mécanistes dans la famille d'ATPase la plus répandue utilisée dans la régulation spatiale de diverses cargaisons cellulaires à travers les procaryotes, et le tout au sein d'une seule cellule.

On ne sait pas combien d'ATPases de la famille ParA/MinD (A/D) sont codées dans un seul organisme. Pour répondre à cette question, nous avons effectué une analyse tBLASTn approfondie en utilisant une séquence protéique consensus, générée à partir d'ATPases A/D bien étudiées, comme requête (voir méthodes). Comme déjà établi17, nous avons constaté que ~ 96% des bactéries de la base de données NCBI Reference Sequence (RefSeq) codent au moins une A/D ATPase (Données supplémentaires 1 et 2). Ces hits ont été regroupés par espèces bactériennes, qui ont ensuite été classées par le nombre de hits A/D. De cette liste initiale, nous avons trouvé de nombreux génomes bactériens codant pour 10 à 20 ATPases A/D. Cependant, ces bactéries avec le plus d'ATPases A/D avaient leurs génomes encodés sur plusieurs plasmides et chromosomes, chacun encodant son propre système de ségrégation d'ADN basé sur ParA18. Pour cette étude, nous nous sommes spécifiquement concentrés sur la compréhension de la façon dont plusieurs ATPases A/D coexistent et coordonnent le positionnement de cargaisons disparates dans la même cellule. Par conséquent, nous avons davantage filtré notre ensemble de données pour identifier les bactéries codant plusieurs ATPases A/D, mais un seul chromosome et aucun plasmide stable (Données supplémentaires 1 et 2). Même après avoir pris en compte les bactéries dont les génomes sont codés sur plusieurs éléments génétiques, notre analyse bioinformatique a révélé que plus d'un tiers des bactéries séquencées codent pour plusieurs ATPases A/D (Fig. 1a, Données supplémentaires 1 et 2).

a 96 % des génomes bactériens séquencés codent au moins une A/D ATPase et 35 % en codent plusieurs. Chaque pointe représente une espèce bactérienne et la longueur de pointe indique le nombre de hits A/D uniques par bactérie. b H. neapolitanus encode sept systèmes de positionnement putatifs de type ParA/MinD. L'analyse du voisinage génique implique les cargaisons putatives associées à chaque putative A/D ATPase. c L'alignement de séquences multiples de chaque A/D ATPase de H. neapolitanus contre des membres de la famille ParA/MinD vérifiés expérimentalement implique en outre les cargaisons putatives identifiées par l'analyse du voisinage des gènes. Chacune des ATPases A/D putatives dans H. neapolitanus se regroupe avec des membres de la famille dont il a été démontré qu'ils positionnent les cargaisons cellulaires indiquées (orange) dans d'autres bactéries.

Nous avons ensuite cherché à déterminer comment plusieurs ATPases A/D peuvent coexister dans la même cellule pour positionner des cargaisons disparates. Pour répondre à cette question, nous avons identifié un organisme de notre liste de bactéries codant plusieurs ATPases A/D (Données supplémentaires 1 et 2). Parmi les 1 % de bactéries (codant six ATPases A/D ou plus), nous avons identifié plusieurs agents pathogènes, notamment les espèces Clostridia, Burkholderia, Mycobacteria, Vibrio, Pseudomonas et Xanthomonas. Nous avons également identifié l'organisme non pathogène et expérimentalement traitable, H. neapolitanus, un chimioautotrophe à croissance lente et oxydant le soufre qui code sept ATPases A / D putatives sur un chromosome (Fig. 1b). La régulation spatiale par les A/D ATPases a été largement étudiée chez des bactéries modèles à croissance rapide. Nous avons intentionnellement choisi une bactérie à croissance lente (temps de doublement de 6 h) car les événements peu fréquents de ségrégation de l'ADN et de division cellulaire permettaient de plus grandes fenêtres d'observation et une vue plus directe de la dynamique du trafic d'organelles. La maniabilité, le taux de croissance lente et l'abondance des ATPases A/D ont fait de H. neapolitanus un choix idéal pour une étude plus approfondie.

Pour déterminer si les hits A / D ATPase chez H. neapolitanus étaient effectivement des régulateurs spatiaux, nous avons effectué une analyse de voisinage de gènes (GNA) pour identifier les cargaisons putatives (Fig. 1b). Le GNA nous permet de déduire la fonction car les gènes A/D ATPase sont souvent codés près des locus associés à la cargaison. Par exemple, le système de ségrégation des chromosomes ParABS est généralement codé près d'OriC19. De manière frappante, les cargaisons putatives que nous avons identifiées à l'aide de cette approche incluent le chromosome et toutes les cargaisons connues à base de protéines de la famille A/D ATPase20,21. Alors que la régulation spatiale de ces diverses cargaisons a été étudiée individuellement dans de nombreuses bactéries modèles différentes, leur positionnement coordonné par plusieurs ATPases A/D n'a jamais été étudié ensemble dans un seul organisme.

Comme deuxième ligne de preuves bioinformatiques reliant chaque A/D ATPase à une cargaison spécifique, nous avons étudié la conservation des voisinages du gène A/D ATPase à l'aide de l'analyse FlaGs (Flanking Genes)22. L'analyse FlaGs prédit les associations fonctionnelles en prenant une liste d'accessions de protéines NCBI comme entrée et en regroupant les protéines codées par le voisinage en groupes homologues. Les homologues de chaque ATPase A / D chez H. neapolitanus ont été identifiés à l'aide de BLASTp, et les meilleurs résultats ont été utilisés comme données d'entrée pour l'analyse des FlaG (Fig. 1 supplémentaire). L'analyse montre une forte conservation des voisinages du gène A/D ATPase dans plusieurs phylums bactériens, impliquant davantage les cargaisons putatives. En raison des données limitées sur les ATPases A/D associées à la conjugaison10 ou au métabolisme de l'azote, nous avons exclu ces occurrences d'une enquête plus approfondie dans cette étude.

Avec les cinq ATPases A/D restantes, nous avons effectué un alignement de séquences multiples contre des membres de la famille ParA/MinD qui avaient été précédemment établis pour positionner une cargaison cellulaire (Fig. 1c). Chaque ATPase A/D de H. neapolitanus s'est regroupée avec un membre spécifique de la famille connu pour positionner une cargaison cellulaire spécifique dans d'autres bactéries : le chromosome (ParA2), le divisome (MinD23), le carboxysome (McdA4,5), le flagelle (FlhG6,7) et le groupe de chimiotaxie (ParC8,9). Ces données fournissent une troisième ligne de preuves qui implique davantage les cargaisons putatives identifiées par notre GNA. Nous avons ensuite cherché à identifier directement le rôle de chaque A/D ATPase dans le positionnement des cargos impliqués par la bioinformatique.

La ségrégation des chromosomes avant la division cellulaire est essentielle à la survie cellulaire. Chez la plupart des bactéries, la ségrégation et l'héritage fidèles des chromosomes sont médiés par un système ParAB codé près d'OriC19. Sans ParAB, l'ADN est hérité de manière asymétrique, ce qui entraîne des cellules anucléées et polyploïdes, et une remise en forme ou une mort cellulaire réduite2. Chez H. neapolitanus, il existe un système putatif parAB codé près d'OriC (Fig. 2a). Pour imager la ségrégation des chromosomes, l'homologue ParB, codé en aval du gène putatif parA (Hn2335), a été fusionné à la protéine fluorescente monomérique Neon Green (mNG). ParB-mNG a été observé sous la forme d'un ou deux points lacrymaux par cellule (Fig. 2b). L'analyse de la population a montré que les cellules plus courtes avaient un seul foyer au milieu de la cellule, tandis que les cellules plus longues avaient deux foyers aux quarts de la cellule (Fig. 2b). Lorsque le gène putatif parA (Hn2335) a été supprimé, les foyers ParB-mNG étaient complètement absents dans 25% des cellules (Fig. 2d supplémentaire). Lorsque des foyers ParB étaient présents, ils étaient positionnés au hasard quelle que soit la longueur de la cellule (Fig. 2c) et significativement plus lumineux que ceux des cellules WT (type sauvage) (Fig. 2e supplémentaire). La complémentation avec Hn2335 à un locus exogène a restauré le positionnement des foyers (Fig. 2h supplémentaire). Ces données suggèrent que les chromosomes répliqués dans ∆Hn2335 n'étaient plus fidèlement séparés, entraînant des cellules anucléées et polyploïdes.

a–d Hn2335 est requis pour la ségrégation des chromosomes. un Hn2335 se trouve près d'OriC et a un homologue ParB codé en aval. b, c La région d'origine du chromosome a été étiquetée en marquant l'homologue ParB. Rouge clair : 1 focus/cellule ; rouge foncé : 2 foyers/cellule. Les cellules WT courtes avaient un seul foyer au milieu de la cellule, tandis que les cellules plus longues avaient deux foyers aux quarts de position. Les cellules ΔHn2335 affichaient un positionnement aléatoire des foyers ParB quelle que soit la longueur de la cellule. d Les diagrammes de dessins animés illustrent la ségrégation des chromosomes dans les cellules WT et ΔHn2335. e–h Hn1364 est requis pour le positionnement en division. e Hn1364 se trouve en amont de minE. f, g Le positionnement du divisome a été déterminé par l'emplacement des sites de constriction. Chaque point sur le graphique de densité représente un site de constriction identifié. Dans les cellules WT, les sites de constriction se trouvaient au milieu de la cellule. Dans ΔHn1364, des sites de constriction ont été trouvés sur toute la longueur de la cellule. h Les diagrammes de dessins animés illustrent la division cellulaire dans les cellules WT et ΔHn1364. i–l Le positionnement du carboxysome est déterminé par McdA. i Hn0912 (mcdA) se trouve à proximité des gènes codant pour les protéines de la coque des carboxysomes et Rubisco. j, k Les carboxysomes ont été visualisés en marquant la petite sous-unité de l'enzyme Rubisco, cbbS. Chaque point sur le graphique de densité représente un foyer de carboxysome. Dans les cellules WT, les carboxysomes sont répartis sur toute la longueur de la cellule. Dans ΔmcdA, les carboxysomes formaient de grands foyers polaires à un ou aux deux pôles. l Les diagrammes de dessins animés illustrent la distribution des carboxysomes dans les cellules WT et ΔHn0912. m–p Hn0716 est nécessaire pour réguler la position des flagelles et le nombre de copies. m Hn0716 se trouve à proximité des gènes associés aux flagelles. n, o La localisation des flagelles a été visualisée en marquant un composant du corps basal flagellaire, fliN. Chaque point sur le graphique de densité représente un foyer FliN. Les cellules WT avaient un seul foyer FliN polaire. Dans les cellules ΔHn0716, les foyers FliN étaient positionnés de manière plus aléatoire le long de la cellule. p Les diagrammes de dessins animés illustrent la localisation et le nombre de flagelles dans les cellules WT et ΔHn0716. q – t Hn0722 est nécessaire pour le positionnement du cluster de chimiotaxie. q Hn0722 se trouve à proximité des gènes associés à la chimiotaxie. r, s Les grappes de chimiotaxie ont été visualisées en marquant le régulateur de réponse, cheY. Chaque point sur le graphique de densité représente un foyer CheY. Les cellules WT avaient un seul foyer polaire CheY. Les cellules mutantes ΔHn0722 n'avaient généralement pas de foyers CheY. t Les diagrammes de dessins animés représentent des grappes de chimiotaxie dans les cellules WT et ΔHn0722. (Toutes les images) Les micrographies présentées sont des images représentatives d'au moins 3 expériences. Barre d'échelle : 2 μm. (Tous les graphiques) Les cellules ont été analysées et quantifiées à l'aide de MicrobeJ. Sur l'axe y, les cellules sont triées par longueur de cellule croissante, avec des cellules plus courtes en haut et des cellules plus longues en bas. L'axe des x représente la distance à partir du milieu de la cellule en microns ; la ligne verticale centrale équivaut à une distance de zéro à partir du milieu de la cellule. Chaque point représente l'endroit où un foyer a été trouvé sur la longueur de la cellule. Pour tous les tracés de densité, les couleurs plus claires représentent une densité plus élevée, les couleurs plus foncées représentent une densité plus faible. Pour les graphiques de flagelles, de chimiotaxie et de carboxysomes, le pôle cellulaire le plus proche d'un foyer était orienté vers la gauche; les foyers dans la moitié droite du graphique indiquent la présence d'un deuxième foyer. Axes du graphique pour les chromosomes, les carboxysomes, les flagelles et les mutants marqués par la chimiotaxie : plage de l'axe y (longueur de la cellule) : 0,8 à 2,1 μm ; Plage de l'axe des abscisses (distance à partir du milieu de la cellule) : −1,1–1,1 μm. L'axe X des cellules ΔflhG est de 0,5 à 1,8 μm. Axes du graphique pour le divisome : plage de l'axe y (longueur de la cellule) : 1,5 à 3,0 μm ; Plage de l'axe des abscisses (distance à partir du milieu de la cellule) : −1,5–1,5 μm. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Nous avons ensuite effectué une microscopie accélérée des foyers ParB-mNG et des nucléoïdes colorés au SYTOX pour observer la ségrégation des chromosomes en temps réel. Les cellules WT du nouveau-né ont un seul foyer ParB au milieu de la cellule, qui se divise ensuite en deux foyers qui se séparent de manière bidirectionnelle vers les quarts de la cellule en croissance (Fig. 2f supplémentaire et Film supplémentaire 1A). Le positionnement des foyers dans les quartiers cellulaires a été maintenu, ce qui est ensuite devenu la position médiane de chaque cellule fille après la division. La ségrégation et l'héritage fidèles des chromosomes ont été perdus lorsque le gène putatif parA (Hn2335) a été supprimé (Fig. 2g supplémentaire et Film supplémentaire 1B). De nombreuses cellules avaient un seul grand foyer ParB au niveau d'un pôle cellulaire qui ne s'est pas divisé et tout l'ADN a été concentré dans une seule cellule fille lors de la division. Ces filles polyploïdes ont continué à se diviser, tandis que les filles anucléées n'étaient plus viables. Ces données ont confirmé que l'augmentation des intensités des foyers ParB dans le mutant de délétion représente une augmentation du nombre de copies chromosomiques dans ces cellules. En résumé, l'A/D ATPase codée par Hn2335 est nécessaire pour une ségrégation fidèle des chromosomes (Fig. 2d) et nous appellerons désormais cette protéine ParA.

Un positionnement correct du divisome garantit que lorsqu'une cellule se divise, les deux cellules filles ont à peu près la même longueur. Sans le système Min, la division se produit dans n'importe quelle région sans nucléoïde24, produisant des minicellules anucléées, les produits des divisions polaires. Nos analyses bioinformatiques ont montré que la protéine codée par Hn1364 est un homologue de MinD, et immédiatement en aval de ce gène dans le même opéron se trouve un gène codant pour un homologue de MinE (Fig. 2e). Pour déterminer si Hn1364 était effectivement impliqué dans le positionnement des divisions, nous avons analysé les cellules en division et identifié leurs sites de constriction par rapport à la longueur des cellules (Fig. 2f, g). Les cellules WT se sont divisées près du milieu de la cellule (Fig. 2f et Fig. 3d supplémentaire) tandis que les cellules ΔHn1364 se sont divisées de manière asymétrique (Fig. 2g et Fig. 3e supplémentaire). L'analyse de la population des cellules en division a identifié des sites de constriction à mi-cellule dans 97% des cellules WT, contre seulement 41% des cellules ΔHn1364 (Fig. 3f supplémentaire et Film supplémentaire 2). En plus des événements de division asymétrique uniques, 9% des cellules en division dans la population mutante ΔHn1364 ont formé plusieurs sites de division simultanément sur la longueur de la cellule (Fig. 3e supplémentaire, Fig. 3g supplémentaire et Film supplémentaire 2C). Les divisions inégales ont entraîné une plus grande variation de la longueur des cellules (Fig. 3h supplémentaire). La complémentation avec Hn1364 à un locus exogène a restauré la constriction des cellules médianes et les événements de division unique (Fig. 3j supplémentaire). Dans l'ensemble, nos résultats montrent que Hn1364 est essentiel pour positionner le divisome au milieu de la cellule (Fig. 2h) et nous appellerons désormais cette protéine MinD.

Les microcompartiments bactériens, ou BMC, sont de grands organites à base de protéines icosaédriques qui encapsulent des réactions métaboliques sensibles pour fournir aux procaryotes des avantages de croissance distincts25. Malgré leur importance, on sait peu de choses sur la régulation spatiale des BMC. Le modèle BMC est le carboxysome fixateur de carbone trouvé dans les cyanobactéries et les protéobactéries26. Il a été récemment découvert qu'une ATPase A / D, que nous avons appelée Maintien de la protéine A de distribution des carboxysomes (McdA), est répandue parmi les bactéries contenant des carboxysomes, y compris H. neapolitanus (Fig. 2i) 4. McdA espace les carboxysomes sur le nucléoïde avec sa protéine partenaire, McdB27,28. Pour démontrer son exigence pour le positionnement des carboxysomes, nous avons visualisé les carboxysomes en marquant la petite sous-unité de l'enzyme Rubisco encapsulée (cbbS) avec mTurquoise2 pour former CbbS-mTQ. Comme indiqué précédemment, dans les cellules WT, les carboxysomes sont répartis sur toute la longueur de la cellule (Fig. 2j, Fig. 4d supplémentaire). Dans le mutant de délétion (ΔmcdA), les agrégats de carboxysomes forment un grand foyer polaire brillant à un ou parfois aux deux pôles (Fig. 2k, Fig. 4d, e supplémentaire). La complémentation avec mcdAB à un locus exogène a restauré le positionnement du carboxysome (Fig supplémentaire 4h). Ces données sont cohérentes avec nos observations précédentes à l'aide de TEM, qui ont montré que les foyers dans la population mutante représentent une agrégation de carboxysomes assemblés28.

Nous étendons ici nos découvertes précédentes avec une microscopie accélérée à long terme. Dans les cellules WT, les carboxysomes sont positionnés dynamiquement le long de la longueur de la cellule sur plusieurs générations (Fig. 4f supplémentaire et Film supplémentaire 3A). Dans le mutant de délétion, les agrégats de carboxysomes polaires étaient stagnants (Fig. 4g supplémentaire et Film supplémentaire 3B). Ensemble, nos découvertes montrent que l'A/D ATPase codée dans l'opéron carboxysome, que nous avons appelé McdA, est essentielle pour distribuer les carboxysomes sur toute la longueur de la cellule et assurer l'homéostasie des organelles après la division (Fig. 2l).

Les flagelles sont des structures filamenteuses externes qui permettent la motilité bactérienne. Les bactéries varient dans l'emplacement, le nombre et le motif des flagelles. De nombreuses bactéries codent une ATPase A / D appelée FlhG dans leur opéron flagellaire, qui est essentielle pour divers schémas de flagellation chez de nombreuses bactéries7, mais les mécanismes restent flous (discussion supplémentaire). Chez les flagellés polaires, la suppression de flhG entraîne généralement des modifications du nombre et de la motilité des flagelles6,29,30,31,32,33,34. Pendant ce temps, dans l'organisme péritriche, Bacillus subtilis, la suppression de flhG entraîne des modifications de l'emplacement des flagelles35. Étonnamment, la suppression de flhG dans l'organisme amphitriche, Campylobacter jejuni, entraîne également des défauts de division cellulaire36,37.

Notre analyse bioinformatique suggère que Hn0716 dans l'opéron flagelle code pour un homologue FlhG (voir Fig. 1c). Pour déterminer si Hn0716 est impliqué dans la régulation spatiale flagellaire, nous avons d'abord visualisé une fusion mNG de FliN, qui est un composant du corps basal flagellaire qui s'assemble à la face cytoplasmique de la membrane (Fig. 2m)38. Les cellules WT avaient un seul foyer mNG-FliN au pôle cellulaire extrême (Fig. 2n). Dans les cellules ΔHn0716, les foyers FliN n'étaient plus fidèlement positionnés (Fig. 2o) et les cellules étaient plus susceptibles d'avoir zéro ou plusieurs foyers (Fig. 5d supplémentaire). La complémentation avec Hn0716 à un locus exogène a restauré la localisation des foyers FliN aux pôles (Fig. 5i supplémentaire). Ces données suggèrent que Hn0716 est nécessaire pour positionner un seul flagelle à un seul pôle chez H. neapolitanus.

Nous avons ensuite cherché à déterminer si ces modifications du positionnement de FliN affectaient la motilité cellulaire. Des tests de motilité dans de la gélose molle ont révélé que les cellules ΔHn0716 n'étaient pas mobiles (Fig. 5g supplémentaire). La perte de motilité peut être due à un mauvais positionnement des flagelles, à une perte de flagelles ou à une hyperflagellation. Pour imager les flagelles, nous avons conçu la flagelline T185C, qui permet le marquage fluorescent des flagelles via l'ajout d'une tache de maléimide réactive à la cystéine au support39. Nous avons constaté que les cellules WT H. neapolitanus sont monotriches, avec un seul flagelle polaire émanant du foyer FliN (Supplementary.Fig. 5h). Les cellules ΔHn0716 avaient également des flagelles émanant de foyers FliN, cependant, les cellules étaient hyper-flagellées, avec plusieurs flagelles souvent regroupés sous forme de touffes, émanant de plusieurs foyers FliN. Nous concluons que Hn0716 est nécessaire pour réguler le nombre et la position des flagelles chez H. neapolitanus (Fig. 2p) et nous appellerons désormais cette protéine FlhG. Des études futures étudieront les effets pléiotropes uniques de flhG dans l'assemblage, le nombre et l'emplacement des flagelles, ainsi que la division cellulaire chez H. neapolitanus (discussion supplémentaire).

La motilité bactérienne est dirigée par de grands réseaux hexagonaux appelés clusters de chimiotaxie, composés de chimiorécepteurs, d'une protéine adaptatrice (CheW) et d'une kinase (CheA). Plusieurs mécanismes ont évolué pour contrôler à la fois le nombre et le positionnement des clusters de chimiotaxie, y compris l'utilisation d'ATPases A/D (appelées ParC chez les espèces Vibrio ou PpfA chez R. sphaeroides). Chez les espèces Vibrio, ParC dirige les matrices de chimiotaxie vers une protéine de repère polaire appelée HubP8,40. En conséquence, les cellules filles héritent d'un réseau à leur ancien pôle lors de la division cellulaire. Chez R. sphaeroides, il n'y a pas de points de repère polaires et PpfA distribue des grappes de chimiotaxie sur le nucléoïde9,41. Lorsqu'elle est étudiée, la suppression de l'A/D ATPase modifie le nombre de grappes de chimiotaxie et le positionnement dans les cellules, ce qui entraîne une réduction de la motilité de propagation dans l'agar mou.

Notre analyse bioinformatique a montré que la protéine codée par Hn0722 est un homologue de ParC/PpfA au sein de l'opéron de chimiotaxie de H. neapolitanus (voir Fig. 1c). Pour déterminer si Hn0722 est important pour la régulation spatiale des grappes de chimiotaxie, nous avons d'abord imagé les grappes de chimiotaxie en fusionnant mNG à CheY (Fig. 2q). CheY est un régulateur de réponse qui est phosphorylé par CheA et il a déjà été démontré qu'il colocalise avec des grappes de chimiotaxie chez E. coli42,43. Conformément aux micrographies électroniques des grappes de chimiotaxie chez H. neapolitanus44, CheY-mNG a formé un seul foyer immédiatement proximal à un pôle cellulaire dans ~ 85% des cellules WT (Fig. 2r, Fig. 6d supplémentaire). Cependant, lorsque Hn0722 a été supprimé, le signal CheY-mNG était diffus dans environ 80% de la population cellulaire (Fig. 2s, Fig. 6d supplémentaire). Dans les ~ 20% des cellules ΔHn0722 qui avaient un foyer CheY-mNG, les foyers étaient significativement plus faibles en intensité (Fig. 6e supplémentaire). La complémentation avec les gènes qui se chevauchent Hn0722 et Hn0723 a permis de récupérer des foyers CheY aux pôles (Fig. 6f supplémentaire). Ensemble, nous concluons que Hn0722 est nécessaire pour l'assemblage et le positionnement du cluster de chimiotaxie chez H. neapolitanus (Fig. 2t) et nous appellerons désormais cette protéine ParC.

Jusqu'à présent, nous avons fourni des preuves directes montrant que cinq ATPases A / D positionnent cinq cargaisons cellulaires disparates chez H. neapolitanus (Fig. 2). Nous avons ensuite demandé si chacune des cinq réactions de positionnement se produisait indépendamment les unes des autres. Pour répondre à cette question, nous avons supprimé individuellement chaque ATPase A/D dans chaque souche de fond marquée par la cargaison (Fig. 3). Nous avons constaté que le positionnement des carboxysomes (Fig. 3c) et des flagelles (Fig. 3d) n'était en grande partie pas affecté par la suppression des ATPases A / D distantes. Curieusement, le positionnement ou l'intensité de la focalisation des chromosomes (Fig. 3a), des divisomes (Fig. 3b) et des grappes de chimiotaxie (Fig. 3e) ont tous été influencés dans les cellules ΔflhG, bien qu'avec des phénotypes intermédiaires par rapport à la suppression de l'ATPase A / D dédiée (Fig. 3, encadrés en gras). Ensemble, nos données montrent que chaque ATPase A/D est dédiée au positionnement d'un type de cargaison spécifique et n'est pas directement impliquée dans le positionnement d'autres cargaisons. Cependant, nos données au niveau de la population cellulaire ont également révélé une coordination, une diaphonie et/ou des interdépendances potentielles entre certaines réactions de positionnement. Dans les trois sections suivantes, nous disséquons comment le positionnement de la cargaison par une ATPase A/D peut être indirectement coordonné avec le positionnement et l'héritage d'une cargaison positionnée par une autre ATPase A/D.

Chacune des cinq cargaisons cellulaires a été marquée par fluorescence comme indiqué (à gauche) : un chromosome (ParB-mNG), un divisome b (site d'invagination), des carboxysomes c (CbbS-mTQ), des flagelles d (mNG-FliN) et des grappes de chimiotaxie e (CheY-mNG). (Toutes les images) Les micrographies présentées sont des images représentatives d'au moins 3 expériences. Barre d'échelle : 2 μm. La colonne "Label Only" indique le positionnement WT de chacune des cargaisons fluorescentes. La suppression d'une ATPase A/D a entraîné la mauvaise localisation de sa cargaison spécifique uniquement (rectangles en gras). Les graphiques dans la colonne "étiquette uniquement" et les graphiques dans les rectangles en gras sont dupliqués de la Fig. 2. Axes du graphique pour les mutants marqués par les chromosomes, les carboxysomes, les flagelles et la chimiotaxie : plage de l'axe des x (longueur de la cellule) : 0,8 à 2,1 μm ; plage de l'axe y (distance du milieu de la cellule) : −1,1–1,1 μm. Tous les axes x des cellules ΔflhG sont de 0,5 à 1,8 μm. Axes du graphique pour le divisome : plage de l'axe des abscisses (longueur de la cellule) : 1,5 à 3,0 μm ; plage de l'axe des ordonnées (distance à partir du milieu de la cellule) : −1,5–1,5 μm. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Nous avons montré comment la suppression de parA entraîne une fraction significative de cellules anucléées, car ParA est directement nécessaire à la ségrégation et à l'hérédité des chromosomes après la division cellulaire (Fig. 4a). La suppression de minD ou flhG a également entraîné la formation de cellules anucléées, mais le mécanisme était différent dans chaque cas. Dans les cellules ΔminD, le positionnement des chromosomes (Fig. 4b) et les intensités des foyers ParB (Fig. 4c) étaient similaires à ceux de WT, montrant que la ségrégation des chromosomes était toujours active. Au lieu de cela, c'est le mauvais positionnement des divisions dans les cellules ΔminD et la division cellulaire asymétrique subséquente (Fig. 4d) qui ont indirectement provoqué l'hérédité asymétrique des chromosomes et la formation de cellules anucléées.

a La suppression de l'ATPase A/D requise pour le positionnement du chromosome (parA), du divisome (minD) ou du flagelle (flhG) a entraîné la formation de cellules anucléées (boîtes grises). b Seules les cellules ΔparA avaient des foyers ParB mal positionnés. Les cellules avec un seul foyer ParB sont rouges. Les cellules avec deux foyers ParB sont noires. Les cellules ΔflhG ont maintenu un seul foyer ParB dans les cellules longues, suggérant un défaut de réplication de l'ADN. c Les foyers ParB ne sont plus brillants que dans les cellules ΔparA. WT : n = 1 289 ; ∆parA : n = 773 ; ∆minD : n = 990 ; ∆flhG : n = 747 cellules biologiquement indépendantes. Valeurs p de Kruskal-Wallis : ∆parA : <0,0001 ; ∆minD : 0,97 ; ∆flhG : 1. d La suppression de minD ou flhG a entraîné un mauvais positionnement de la division. Les sites de constriction étaient considérés comme « mi-cellule » lorsqu'ils se trouvaient à moins de 5 % du centre de la cellule le long de l'axe longitudinal. WT : n = 6 ; ∆parA, ∆minD et ∆flhG : n = 5 échantillons biologiquement indépendants. Test ANOVA de Brown-Forsythe et Welch Valeurs p : ∆parA : 0,28 ; ∆minD : <0,0001 ; ∆flhG : <0,0001 e La suppression de flhG a entraîné un effet intermédiaire sur le positionnement des divisions par rapport à ΔminD. Chaque point sur le graphique de densité représente un site de constriction identifié. Les couleurs plus claires représentent une densité plus élevée, les couleurs plus foncées représentent une densité plus faible. Les panneaux b et e sont résumés à partir de la Fig. 3. (Toutes les images) Barre d'échelle : 2 μm. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Dans les cellules ΔflhG, le positionnement des chromosomes (Fig. 4b) et les intensités des foyers ParB (Fig. 4c) étaient également similaires à ceux de WT, suggérant à nouveau que la ségrégation des chromosomes n'était pas affectée. Mais, le mauvais positionnement des divisions n'était pas aussi grave que les cellules ΔminD (Fig. 4d, e), ce qui suggère que les cellules anucléées se formaient via un troisième mécanisme distinct. Curieusement, les cellules ΔflhG étaient moins susceptibles d'avoir deux foyers ParB que les cellules WT (Fig. 4a). Au lieu de cela, les cellules pré-divisionnelles avaient toujours un seul foyer ParB (Fig. 4b) avec des intensités suggérant la présence d'une seule copie chromosomique (Fig. 4c). La microscopie accélérée a confirmé que le positionnement des foyers ParB était activement maintenu (film supplémentaire 4). Par conséquent, les cellules ΔflhG anucléées sont probablement formées en raison de défauts de réplication chromosomique et/ou de division cellulaire prématurée ; une question d'étude future.

Ensemble, les résultats soulignent l'importance de sonder les relations fonctionnelles des ATPases A/D entre elles et le cycle cellulaire bactérien, lorsqu'ils occupent le même organisme.

McdA utilise le nucléoïde comme matrice de positionnement pour distribuer les carboxysomes27,28. Par conséquent, il était surprenant que dans la population mutante ΔparA, toutes les cellules anucléées conservent les carboxysomes (Fig. 5a). Pour déterminer si les cellules anucléées ont synthétisé des carboxysomes de novo ou si les carboxysomes étaient encore hérités après la division, nous avons effectué une microscopie accélérée sur des cellules ΔparA avec des carboxysomes fluorescents (Fig. 5b et Film supplémentaire 5A). Curieusement, les cellules anucléées ont en effet hérité des carboxysomes, mais de la manière la plus inattendue. Lors de la division des cellules ΔparA qui n'ont pas réussi à diviser leurs foyers ParB, les carboxysomes de la cellule à anucléer se sont regroupés immédiatement à côté du plan de division. Le regroupement des carboxysomes coïncidait avec l'action d'enroulement des chromosomes qui s'est produite au niveau du septum invaginant juste avant la division complète et l'hérédité asymétrique des chromosomes (voir Fig. 2g supplémentaire et Film supplémentaire 1B). Une fois la septation terminée, le faisceau massif de carboxysomes a été libéré de manière explosive du nouveau pôle de la cellule anucléée, ce qui a entraîné de multiples foyers de carboxysomes diffusant librement (Fig. 5b et Film supplémentaire 5A). Les cellules anucléées contenant des carboxysomes ne se divisent pas davantage. Nous avons constaté que les cellules anucléées des populations de cellules ΔminD (Fig. 5c et Film supplémentaire 5B) et ΔflhG (Fig. 5d et Film supplémentaire 5C) héritaient également des carboxysomes via le même mécanisme. Ensemble, les données montrent comment le trafic et la distribution des carboxysomes par McdA dépendent de la ségrégation fidèle des chromosomes. Cependant, les cellules anucléées peuvent toujours hériter des carboxysomes dans les souches de délétion parA, minD ou flhG, car les carboxysomes sont grattés des chromosomes mal séparés qui sont enroulés à travers le site d'invagination pendant la septation. Nous supposons que toutes les cargaisons à méso-échelle utilisant des nucléoïdes hérités asymétriquement comme matrice de positionnement montreraient le même mode d'héritage.

a Les carboxysomes sont présents dans les cellules anucléées (cercle en pointillés). Les micrographies présentées sont des images représentatives de 2 expériences. b La microscopie accélérée montre que les carboxysomes (vert) dans les cellules ΔparA sont liés au nucléoïde, mais sont hérités dans les cellules anucléées via la libération du chromosome extrudé. Les carboxysomes sont également hérités dans les cellules anucléées c ΔminD et les cellules anucléées d ΔflhG via le même mécanisme. (Toutes les vidéos) Les flèches blanches mettent en évidence le regroupement des carboxysomes et la libération ultérieure. Barre d'échelle : 1 μm.

L'ATPase A/D qui positionne les clusters de chimiotaxie dans Rhodobacter sphaeroides utilise le nucléoïde comme matrice de positionnement41. Par conséquent, nous avons suspecté que les suppressions d'A/D ATPase résultant en des cellules anucléées auraient un impact indirect sur la régulation spatiale des clusters de chimiotaxie dans ces souches. En effet, nous avons constaté que les souches de délétion parA, minD et flhG, qui forment toutes des cellules anucléées (voir Fig. 4a), présentaient une augmentation correspondante du nombre de cellules dépourvues de grappes de chimiotaxie (Fig. 6a), et lorsque les cellules avaient des foyers, elles étaient nettement plus sombres par rapport à WT (Fig. 6b).

La suppression de parA, minD ou flhG influence le groupe de chimiotaxie un certain nombre (WT : n = 4, ∆parA : n = 4, ∆minD : n = 5, ∆mcdA : n = 4, ∆flhG : n = 4, ∆parC : n = 4 échantillons biologiquement indépendants. Valeurs p du test ANOVA de Brown-Forsythe et Welch : ∆parA : 0,0013, ∆minD : 0,0642, ∆mcdA : 0,1141, ∆flhG : 0,0043, ∆parC : 0,0012) et b assemblage (n = 455 cellules biologiquement indépendantes. Test de Kruskal-Wallis p-values ​​: ∆parA : <0,0001, ∆minD : <0 .0001, ∆mcdA : 0,0171, ∆flhG : <0,0001, ∆parC : <0,0001). Seule la suppression de flhG a considérablement influencé le nombre de flagelles c et l'assemblage d (n = 851 cellules biologiquement indépendantes. Valeurs p du test de Kruskal-Wallis : ∆parA : 0,1161, ∆minD : 0,4433, ∆mcdA : 0,0184, ∆flhG : <0,0001, ∆parC : 0,0051). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Il est important de noter que si les souches ΔparA et ΔminD présentaient des effets modérés sur l'assemblage des clusters de chimiotaxie, la suppression de flhG était plus sévère (Fig. 6a, b). Étant donné que les grappes de chimiotaxie communiquent avec le flagelle pour déplacer la bactérie vers des conditions favorables, nous émettons l'hypothèse que l'assemblage et l'organisation des grappes de chimiotaxie chez H. neapolitanus sont régulés par le positionnement du flagelle. Fait intéressant, cet effet n'était pas réciproque, car la suppression de parC avait un effet minimal sur le nombre de foyers de flagelles (Fig. 6c) ou l'intensité du corps basal des flagelles (Fig. 6d). L'identification des acteurs moléculaires responsables de cette diaphonie dans la régulation spatiale du cluster flagelle et chimiotaxie fait l'objet de travaux futurs. Ensemble, nos données démontrent des interdépendances dans la façon dont les ATPases A/D coordonnent le positionnement des organites à base de protéines entre elles ainsi que les processus de ségrégation de l'ADN et de division cellulaire.

Nous avons démontré expérimentalement que plusieurs ATPases A/D coexistent et coordonnent le positionnement de multiples cargaisons disparates dans la même cellule. Nous avons également montré que le positionnement basé sur A/D est spécifique à la cargaison. Il a été démontré que les ATPases A / D forment des structures de dimères en sandwich très similaires45, 46, 47, 48 et les prédictions d'AlphaFold2 (AF2) suggèrent que c'est également le cas pour les cinq ATPases A / D de H. neapolitanus étudiées ici (Fig. 7a-b supplémentaire). Les similitudes structurelles suggèrent qu'il existe des interfaces conservées uniques à chaque ATPase A/D qui fournissent une spécificité, liant une ATPase A/D à sa cargaison particulière.

À l'aide des prédictions AF2 et Rosetta, nous avons déterminé les structures A/D ATPase de H. neapolitanus et identifié les interfaces d'interaction putatives qui fournissent une spécificité à chaque réaction de positionnement. Il existe trois interfaces sur une ATPase A/D qui confèrent une spécificité : (1) l'interface de dimérisation, (2) l'interface d'interaction avec sa matrice de positionnement (nucléoïde ou membrane) et (3) l'interface d'interaction avec sa protéine partenaire, qui relie finalement l'ATPase à sa cargaison. Nous avons identifié ces trois interfaces pour les cinq ATPases A/D chez H. neapolitanus (Fig. 7) et prédit les résidus clés nécessaires à ces associations (Données supplémentaires 3).

a Les structures homodimères des ATPases A / D de H. neapolitanus ont été générées à l'aide d'AlphaFold2 (cyan). Les résidus putatifs pour la spécificité des homodimères sont surlignés en magenta. b Les dimères de a sont orientés sur leur matrice de positionnement - ADN nucléoïde ou membrane. Les résidus putatifs critiques pour la liaison de l'ADN nucléoïde ou de la membrane sont surlignés en rouge. c Structures dimères ancrées avec le peptide interagissant N-terminal à partir de protéines partenaires putatives (orange), qui confèrent une spécificité de cargaison. Boîte agrandie : les résidus prédits critiques pour cette association sont le cyan rempli d'espace sur l'ATPase et l'orange sur la protéine partenaire.

La spécificité à l'interface dimère limite les ATPases A/D à l'homodimérisation et permet ainsi à chaque ATPase A/D de fonctionner indépendamment dans la même cellule sans interférence croisée (Fig. 7a). Les résidus putatifs requis pour l'homodimérisation des cinq ATPases A/D dans H. neapolitanus sont fournis dans les données supplémentaires 3, Tab. 1.

Les ATPases de type ParA utilisent le nucléoïde et les ATPases de type MinD utilisent la membrane interne pour le positionnement de la cargaison. ParA, McdA et ParC ont des résidus basiques à leurs extrémités C pour une liaison non spécifique à l'ADN nucléoïde, tandis que MinD et FlhG ont des séquences de ciblage membranaire (MTS) pour la liaison membranaire (Fig. 7b). Nous avons identifié les résidus prédits requis pour chaque ATPase A/D à associer à leur matrice de positionnement respective (Données supplémentaires 3, onglet 2).

La spécificité de la cargaison pour les A/D ATPases provient de l'interaction avec une protéine partenaire qui soit s'associe à la cargaison, soit est un composant physique de la cargaison elle-même. Les protéines partenaires ont une étendue d'acides aminés enrichis en résidus chargés à l'extrémité N-terminale qui interagit exclusivement avec son A/D ATPase, tandis que le reste de la protéine partenaire est dédié à l'association cargo49. Nous avons généré des modèles d'amarrage de chaque ATPase A/D avec un peptide N-terminal à partir de sa protéine partenaire (Fig. 7c). Les peptides ont été définis comme les 30 premiers résidus de la protéine partenaire putative à partir de l'extrémité N-terminale. Les simulations d'amarrage des peptides ont identifié plusieurs résidus putatifs qui sont essentiels à la spécificité du système entre une ATPase A/D et sa protéine partenaire (Données supplémentaires 3, onglet 3).

Enfin, nous avons effectué une mutagenèse par balayage d'alanine silico sur tous les résidus comprenant l'interface d'interaction des peptides N-terminaux des protéines partenaires ancrées sur leur ATPase A / D apparentée (Données supplémentaires 3, onglet 4). Les valeurs ΔΔG résultantes identifient la mesure dans laquelle chaque résidu contribue à la stabilité de l'interaction de la protéine partenaire avec son apparenté A/D ATPase. Il est important de noter que nos simulations de substitution d'alanine in silico ont identifié tous les résidus qui se sont révélés expérimentalement importants pour l'ancrage du peptide Escherichia coli MinE sur le dimère MinD47, 50, 51 (Fig. 7c supplémentaire). Ensemble, nos données in silico fournissent une feuille de route pour la mutagenèse stratégique et le sondage mécaniste des déterminants de spécificité impliqués dans la ségrégation des chromosomes bactériens, le positionnement de la division cellulaire et le trafic d'organites à base de protéines par les ATPases A/D entre les procaryotes.

L'étude des ATPases A/D s'est concentrée sur une cargaison spécifique d'un certain processus biologique, et en grande partie sur des organismes modèles qui ne codent qu'une ou deux ATPases A/D. Dans ces études, deux questions sont généralement posées : comment une cargaison spécifique trouve-t-elle sa position correcte, et comment cette position évolue-t-elle au fil du temps ? Ici, nous nous sommes concentrés sur les systèmes de positionnement, plutôt que sur un processus spécifique de type cargo ou biologique. Notre approche de biologie des systèmes aborde donc la façon dont plusieurs ATPases A/D coordonnent le positionnement de diverses cargaisons dans la même cellule.

L'encodage de plusieurs ATPases A/D est une fonctionnalité partagée entre les procaryotes. Nous constatons que plus d'un tiers de tous les génomes bactériens séquencés codent pour plusieurs ATPases A / D (Fig. 1a), certaines bactéries codant> 10. Fait intéressant, bien que la plupart des bactéries aient les mêmes cargaisons fondamentales, toutes n'utilisent pas de systèmes de positionnement dédiés basés sur A/D. Par exemple, bon nombre des cargaisons cellulaires que nous avons trouvées ici sont positionnées par des ATPases A/D dans certaines bactéries, comme H. neapolitanus, ne sont pas activement positionnées par des ATPases A/D dans d'autres, comme E. coli. Ce qui nécessite une A/D ATPase pour positionner une certaine cargaison cellulaire dans une bactérie et pas dans une autre reste une question ouverte. Il semble cependant y avoir une limite au nombre d'ATPases A/D qu'une bactérie peut coder. Les ATPases A/D sont également codées dans les génomes des archées52, mais on sait peu de choses sur leurs rôles dans l'organisation subcellulaire. Une étude récente a montré que les espèces archées de plusieurs embranchements, Euryarchaeota en particulier, codent pour plusieurs ATPases A/D53. Plusieurs de ces espèces en contenaient plus d'une douzaine, dont H. volcanii avec 13 ATPases A/D, dont quatre sont des homologues de MinD. De manière frappante, les quatre homologues de MinD n'étaient pas nécessaires pour le positionnement de la division cellulaire, mais un (MinD4) a stimulé la formation de réseaux de chimiotaxie et de l'archaella, qui est l'équivalent fonctionnel du flagelle bactérien. Cette étude souligne l'importance de lier expérimentalement les ATPases A/D à leurs cargaisons cellulaires comme nous l'avons fait ici.

La famille d'ATPases ParA/MinD régule spatio-temporellement une liste croissante de divers complexes à mésoéchelle essentiels aux processus fondamentaux chez les procaryotes, y compris la croissance et la division cellulaires, la ségrégation de l'ADN, la motilité, la conjugaison et la pathogenèse20,21. Par conséquent, comprendre comment les ATPases A/D coordonnent le positionnement des cargaisons cellulaires au bon endroit au bon moment est essentiel pour comprendre la fonction des cellules bactériennes. En utilisant H. neapolitanus comme modèle non pathogène, nos résultats soutiennent fortement l'idée que chaque ATPase est dédiée au positionnement d'une cargaison cellulaire spécifique. Notre modèle a également dévoilé la dépendance du trafic d'organites à base de protéines sur la réplication et la ségrégation fidèles du chromosome ainsi que sur le positionnement de la division cellulaire au milieu de la cellule. Par exemple, alors que la conséquence directe de la suppression de ParA était une mauvaise ségrégation des chromosomes, l'hérédité asymétrique des chromosomes qui en résultait conduisait également à des défauts indirects dans le positionnement des carboxysomes et des grappes de chimiotaxie. Nous avons également identifié une relation épistatique précédemment non caractérisée dans le positionnement des flagelles par FlhG et son influence en aval sur la régulation spatiale du cluster de chimiotaxie par ParC. Il est bien connu que les clusters de chimiotaxie dirigent la motilité cellulaire en contrôlant le sens de rotation des flagelles. Cependant, à notre connaissance, la diaphonie dans la régulation spatiale des grappes de flagelles et de chimiotaxie n'a pas encore été documentée. Des études futures détermineront les acteurs moléculaires impliqués dans la diaphonie entre le positionnement A/D de ces deux cargos cellulaires impliqués dans la motilité cellulaire.

Notre bioinformatique a également identifié une sixième A/D ATPase dans le génome de H. neapolitanus. Hn1669 est une ATPase A/D qui présente une homologie avec VirC1 et est située à proximité des gènes trb, qui codent pour les composants de la machinerie de conjugaison (Fig. 1b). Une seule étude a montré que l'ATPase VirC1, codée sur le plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens, est impliquée dans le recrutement du plasmide Ti conjugatif vers la machine à sécrétion de type IV aux pôles cellulaires10. Curieusement, chez H. neapolitanus, l'homologue de VirC1 est codé sur un élément conjugatif intégratif (ICE) et le gène en aval de cette A/D ATPase code pour un homologue de ParB. Les ICE sont des moteurs majeurs de l'évolution bactérienne et de la propagation des gènes de résistance aux antibiotiques54. Nous n'avons pas encore de conjugaison d'image chez H. neapolitanus, mais nous soupçonnons que cet homologue de ParB se lie et délimite le locus ICE pendant la conjugaison. Il est intéressant de supposer que l'homologue VirC1 et son homologue ParB en aval sont impliqués dans le transport et le positionnement du locus ICE vers la machine à sécrétion de type IV au pôle cellulaire pour la conjugaison.

Alors que les ATPases A/D partagent des points communs de séquence, de structure et biochimiques, les protéines partenaires reliant ces ATPases à leurs cargaisons sont extrêmement diverses. En raison de cette diversité, la protéine partenaire n'a pas toujours été identifiée et, par conséquent, de nombreuses ATPases A/D sont appelées « orphelines »20. L'extrême diversité est largement due aux protéines partenaires fournissant les déterminants de spécificité liant une A/D ATPase à sa cargaison apparentée. Malgré leur extrême diversité, les données du domaine soutiennent l'idée que les protéines partenaires interagissent avec et stimulent leurs ATPases A/D via un mécanisme partagé. Il a été démontré ou suggéré que les protéines partenaires impliquées dans la partition plasmidique et la ségrégation des chromosomes, ainsi que celles nécessaires au positionnement des BMC, des flagelles, des clusters de chimiotaxie et du divisome, interagissent avec leur ATPase A/D via une extrémité N-terminale chargée positivement et désordonnée49. Notre analyse in silico des dimères A/D ATPase amarrés aux peptides N-terminaux de leurs protéines partenaires montre comment des cargaisons spécifiques sont attribuées et comment ces systèmes de positionnement associés coexistent et fonctionnent dans la même cellule sans interférence croisée.

À l'avenir, nous visons à utiliser H. neapolitanus comme modèle pour définir le mode de transport général partagé par l'ensemble de la famille A/D ATPase et pour déterminer comment les réactions de positionnement sont modifiées pour des cargaisons disparates. Ces découvertes sont importantes car les ATPases A/D organisent spatialement essentiellement tous les aspects de la fonction cellulaire bactérienne. Une direction future supplémentaire consiste à vérifier expérimentalement les déterminants de spécificité que nous avons identifiés ici pour chaque protéine et cargaison partenaire, et à tirer parti de ces connaissances dans la conception rationnelle de systèmes de positionnement dans les bactéries. Ces contributions devraient être importantes car les systèmes auto-organisés minimaux sont des outils vitaux pour la biologie synthétique55. Notre objectif est de concevoir des systèmes de positionnement autonomes minimaux (MAPS) constitués d'une ATPase de positionnement et de leur peptide N-terminal de protéine partenaire comme une "étiquette de bagage" à utiliser comme régulateurs spatiaux pour les cargaisons naturelles et synthétiques chez les bactéries hétérologues.

L'analyse tBLASTn a été effectuée à l'aide d'une séquence consensus ParA/MinD (xKGGxxK[T/S]), en tant que requête sur la base de données des génomes représentatifs RefSeq avec des séquences cibles maximales à 5000 et un seuil de valeur E à 0,0001. Les séquences ont été filtrées pour celles qui partageaient une homologie de séquence et avaient l'un des gènes cargo putatifs identifiés, confirmés à l'aide de webFlaGs (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32956448/). La requête de consensus a été générée à l'aide de COBOLT (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17332019/).

Quelques génomes représentatifs ont été sélectionnés pour afficher la conservation du voisinage des gènes. L'identification des origines de réplication (OriC) a été réalisée à l'aide d'Ori-Finder (https://bmcbioinformatics.biomedcentral.com/articles/10.1186/1471-2105-9-79). La figure d'analyse FlaGs a été générée à l'aide de Gene Graphics (https://katlabs.cc/genegraphics/).

Les séquences ont été alignées à l'aide de Clustal Omega. L'arbre résultant a été importé dans iTOL pour générer un arbre sans racine. (Numéros d'accession NCBI : Hn2335—ACX97145.1; Hn1364—ACX96198.1; Hn0912—ACX95755.1; Hn0716—ACX95565.1; Hn0722—ACX95571.1; Hn1669—ACX96495.1; Hn0255—ACX9511 8.1).

Tous les mutants décrits dans cette étude ont été construits à l'aide de WT Halothiobacillus neapolitanus (Parker) Kelly et Wood (ATCC® 23641™) achetés auprès de l'ATCC. Les cultures ont été cultivées dans du milieu ATCC® 290 : milieu S-6 pour thiobacilles (Hutchinson et al., 1965) et incubées à 30 °C, sous agitation à 130 tr/min dans de l'air additionné de 5 % de CO2. Les souches ont été conservées congelées à -80 ° C dans du DMSO à 10 %.

Toutes les constructions ont été générées à l'aide de Gibson Assembly et vérifiées par séquençage. Les fragments à assembler ont été synthétisés par PCR ou commandés sous forme de gBlock (IDT). Les constructions contenaient de l'ADN flanquant qui variait de 750 à 1100 pb de longueur en amont et en aval du site d'insertion ciblé pour favoriser la recombinaison homologue dans les locus génomiques cibles. Le clonage des plasmides a été réalisé dans des cellules E. coli Top10 ou Stellar chimiquement compétentes (Takara Bio).

Des cellules compétentes de H. neapolitanus ont été générées comme indiqué précédemment. En bref, 1 L de culture a été cultivé jusqu'à une DO de 0,1 à 0,15. Les cultures ont été récoltées par centrifugation à 5000 x g pendant 20 min à 4°C. Les culots ont été remis en suspension et lavés deux fois avec 0,5 volume d'eau nanoporeuse glacée. Toutes les étapes de centrifugation de lavage ont été réalisées à 3000xg pendant 30 min à 4°C. Le culot résultant après lavage a été remis en suspension dans 1 × 10-3 volumes d'eau nanoporeuse glacée. Ces cellules compétentes ont été utilisées immédiatement ou congelées à -80 ° C pour une utilisation future. Les cellules compétentes congelées ont été décongelées à 4 °C avant utilisation.

50 à 100 µL de cellules compétentes ont été mélangés avec 5 µL d'ADN plasmidique (1 à 5 µg) et incubés sur de la glace pendant 5 min. Ce mélange a ensuite été transféré dans un tube contenant 5 ml de milieu S6 glacé sans antibiotiques et incubé sur de la glace pendant 5 min. Les transformations ont été récupérées pendant 16 à 36 h, sous agitation à 130 tr/min, à 30 °C, dans de l'air additionné de 5 % de CO2. Les clones ont été sélectionnés par étalement sur milieu sélectif avec des antibiotiques. Les colonies ont été réensemencées. Les colonies restreakées ont été vérifiées pour la mutation par PCR.

Pour la fusion fluorescente native de ParB-mNG, mNG-FliN et CheY-mNG, la séquence codant pour la protéine fluorescente mNeonGreen (mNG) a été attachée à la région 3' ou 5' des séquences codantes natives, séparées par un lieur GSGSGS. Pour la fusion fluorescente native de Cbbs-mTQ, la séquence codant pour la protéine fluorescente mTurquoise (mTQ) a été attachée à la région 3' de la séquence codante native, séparée par un lieur GSGSGS. Une cassette de résistance à la kanamycine a été insérée avant le gène des étiquettes N-terminales ou après le gène des étiquettes C-terminales. Lorsque nécessaire, le promoteur a été dupliqué. Le mutant a été sélectionné par étalement sur des plaques de gélose S6 additionnées de 50 µg/mL de kanamycine. Toutes les fusions ont été vérifiées par PCR.

Pour les délétions de Hn2335, Hn1364, Hn0912 et Hn0722, les gènes ont été remplacés par une cassette de résistance à la spectinomycine, suivie d'un promoteur dupliqué pour le gène en aval. La suppression de Hn0716 a été obtenue en optimisant les codons du gène en aval et en insérant la cassette de résistance à la spectinomycine après ce gène optimisé en codons. Les mutants ont été sélectionnés par étalement sur des plaques de gélose S6 additionnées de 50 μg/mL de spectinomycine. Toutes les mutations ont été vérifiées par PCR.

Les gènes délétés (Hn2335, Hn1364, Hn0912, Hn0716 et Hn0722) ont été placés individuellement sous l'expression d'un promoteur Ptrc, et insérés dans un site neutre, situé entre les gènes Hn0933 et Hn0934. Les mutants ont été sélectionnés par étalement sur des plaques de gélose S6 additionnées de 25 µg/mL de chloramphénicol. L'insertion a été vérifiée par PCR. Pour l'imagerie, les cellules ont été cultivées jusqu'à une DO de 0, 1, induites avec 0, 0, 25, 1, 5, 10 et / ou 50 µM d'IPTG pendant jusqu'à 6 h et imagées pour la complémentation à divers moments. Hn2335 complété avec 50 µM d'IPTG pendant 3 h. Hn1364 complété avec 50 µM d'IPTG pendant 6 h. Hn0716 complété par une expression fuyante du promoteur Ptrc et l'induction n'était pas nécessaire. Hn0912 et Hn0722 ne se complétaient pas avec ces gènes seuls. Pour ces deux mutants, des constructions supplémentaires ont été réalisées pour inclure les gènes chevauchants voisins : Hn0911-Hn0912 et Hn0722-Hn0723. Les constructions ont été générées, vérifiées, induites et imagées comme détaillé ci-dessus. Hn0911-Hn0912 complété avec 50 µM IPTG pendant 3 h. Hn0722-Hn0723 complété avec 50 µM IPTG pendant 3 h.

Toutes les microscopies de cellules vivantes ont été réalisées en utilisant des cellules à croissance exponentielle. 3 à 5 µL de cellules ont été déposés sur un morceau d'agarose UltraPure à 2 % (Invitrogen, numéro de catalogue 16500) + tampon S6 et imagés sur une boîte à fond de verre de 35 mm (MatTek, numéro de catalogue P35G-1.5-14-C). Toutes les images de fluorescence et de contraste de phase ont été réalisées à l'aide d'un microscope inversé motorisé Nikon Ti2-E contrôlé par le logiciel NIS Elements avec une source de lumière LED SOLA 365, un objectif 100X (Oil CFI Plan Apochromat DM Lambda Series for Phase Contrast) et une caméra sCMOS rétro-éclairée Photometrics Prime 95B ou une caméra Hamamatsu Orca Flash 4.0 LT + sCMOS. ParB-mNG, mNG-FliN et CheY-mNG ont été imagés à l'aide d'un ensemble de filtres "GFP" (C-FL GFP, Hard Coat, High Signal-to-Noise, Zero Shift, Excitation : 470/40 nm [450-490 nm], Emission : 525/50 nm [500-550 nm], Miroir dichroïque : 495 nm). Les carboxysomes marqués CbbS-mTQ ont été imagés à l'aide d'un ensemble de filtres "CFP" (C-FL CFP, Hard Coat, High Signal-to-Noise, Zero Shift, Excitation : 436/20 nm [426-446 nm], Emission : 480/40 nm [460-500 nm], Miroir dichroïque : 455 nm). La fluorescence DAPI a été imagée à l'aide d'un ensemble de filtres "DAPI" standard (C-FL DAPI, Hard Coat, High Signal-to-Noise, Zero Shift, Excitation : 350/50 nm [325-375 nm], Emission : 460/50 nm [435-485 nm], Miroir dichroïque : 400 nm). Les flagelles conjugués au maléimide Alexa Fluor 594 C5 ont été imagés à l'aide d'un ensemble de filtres "TexasRed" (C-FL Texas Red, Hard Coat, High Signal-to-Noise, Zero Shift, Excitation : 560/40 nm [540-580 nm], Emission : 630/75 nm [593-668 nm], Miroir dichroïque : 585 nm).

Pour la microscopie time-lapse multigénérationnelle, 1,5% d'agarose UltraPure (Invitrogen, numéro de catalogue 16500) + tampons S6 ont été coulés dans des plats à fond de verre de 35 mm (MatTek, numéro de catalogue P35G-1.5-14-C). Les boîtes ont été préincubées à 30 °C dans 5 % de CO2 pendant au moins 24 h. 4 µl de cellules à croissance exponentielle ont été déposés sur le tampon de gélose. La température, l'humidité et les concentrations de CO2 ont été contrôlées avec un système d'incubation Tokai Hit. Le logiciel NIS Elements a été utilisé pour l'acquisition des images. Les cellules ont été préincubées dans le haut de la scène pendant au moins 30 min avant l'acquisition de l'image. Les vidéos ont été prises à raison d'une image par 2,5 à 5 min pendant une durée de 12 à 24 h.

Plusieurs champs de vision ont été capturés pour chaque mutant. Tous les canaux de fluorescence ont été soumis à une soustraction de fond sur Fidji avec un rayon de boule roulante de 50 μm. Les images de fluorescence soustraites à l'arrière-plan ont été fusionnées avec des images à contraste de phase pour créer des composites utilisés pour l'analyse d'images. L'analyse d'image, y compris l'identification des cellules, la quantification de la longueur des cellules, la localisation des foyers, le nombre de foyers, l'intensité de la fluorescence des foyers et l'identification des sites de constriction, a été effectuée à l'aide du plugin Fidji MicrobeJ 5.13I56,57. La détection et la segmentation du périmètre cellulaire ont été effectuées à l'aide du descripteur en forme de tige avec des paramètres de seuil par défaut à une tolérance de 56. Les paramètres de détection maximum ont été définis individuellement pour chaque cargaison. Pour la détection des foyers ParB-mNG (cargo = chromosome), la tolérance et le score z ont tous deux été définis sur 100. Pour la détection des foyers CheY-mNG (cargo = chimiotaxie), la tolérance a été définie sur 150 et le score z sur 100. Pour la détection des foyers mNG-FliN (cargo = flagelles), la tolérance a été définie sur 710 et le score z sur 69. go = carboxysome) détection des foyers, la détection ponctuelle a été utilisée à la place de la détection des foyers et la tolérance a été fixée à 1010. Les résultats ont été vérifiés manuellement à l'aide de l'éditeur d'expériences et les cellules non segmentées ont été coupées à l'aide d'un coupe-particules. Les associations, les descripteurs de forme, les profils et la localisation ont été enregistrés pour chaque souche. Les graphiques de localisation ont été générés automatiquement via MicrobeJ. Les graphiques d'intensité de fluorescence et les graphiques de nombre de foyers ont été réalisés dans GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, www.graphpad.com).

Les cellules ont été récoltées par centrifugation à 5000 g pendant 5 min. Après centrifugation, les cellules ont été lavées dans du PBS, pH 7,4. Le culot cellulaire résultant a été remis en suspension dans 100 μL de PBS et coloré avec SytoxBlue (Invitrogen, numéro de catalogue S34862) à une concentration finale de 500 nM. Les échantillons ont été incubés dans l'obscurité, à température ambiante pendant 5 à 10 min. Les cellules colorées ont été directement chargées sur un tampon de gélose S6 qui avait été infusé avec 500 nM de SytoxBlue.

Onze images ont été capturées au cours de 2 min. Les carboxysomes ont été comptés dans chaque cadre. Le nombre le plus élevé compté par cellule a été utilisé pour le comptage des carboxysomes.

Les tests de motilité ont été exécutés en S6 dans de la gélose à 0,4 %. Les cellules ont été cultivées sur une plaque de milieu S6. Les colonies individuelles ont été inoculées dans des tubes ou des plaques de milieu de motilité et incubées à 30 °C dans de l'air additionné de 5 % de CO2. Les tubes et les plaques ont été vérifiés quotidiennement pour la motilité pendant 2 semaines.

La flagelline de H. neapolitanus a été identifiée à l'aide d'une recherche d'homologie BLAST avec Hag de Bacillus subtilis comme requête. Un seul gène de la flagelline a été trouvé. Plusieurs résidus de thréonine et de sérine ont été considérés pour la mutagenèse de la cystéine. Les résidus ont été mutés à l'aide du kit de mutagenèse dirigée Q5 (NEB, E0554S). Les clones ont été vérifiés pour la mutation de la cystéine par séquençage.

Le colorant maléimide Alexa Fluor 594 C5 (Invitrogen, A10256) a été remis en suspension dans du DMSO à la concentration de travail de 10 mM. Les cultures de H. neapolitanus ont été cultivées jusqu'à une DO de 0,1 à 0,2. Les cultures ont été ajustées à un pH de 7,0 en utilisant du PBS, pH 11,7. Les cellules à un pH ajusté de 7,0 ont ensuite été colorées avec le colorant maléimide Alexa Fluor 594 C5 à une concentration finale de colorant de 100 µM. Les cultures de coloration ont été incubées pendant une nuit à 4°C. Les cellules colorées ont été lavées 4+ fois dans du PBS, pH 7,4. Toutes les étapes de centrifugation ont été réalisées à 5000 × g pendant 3 min.

Pour les analyses de population entière, telles que les mesures d'intensité de fluorescence et de longueur de cellule, nous avons effectué un test non paramétrique de Wilcoxon (Kruskal-Wallis) suivi d'un test de comparaisons multiples de Dunn. Pour le pourcentage d'analyses de population, telles que le nombre de foyers ou la présence de sites de constriction à mi-cellule, les populations ont été analysées en tant que champs de vision distincts et les valeurs récapitulatives ont été tracées en tant que points de données distincts. Nous avons ensuite effectué un test ANOVA de Brown-Forsythe et Welch suivi du test de comparaisons multiples T3 de Dunnett. GraphPad Prism (version 9.5.1) a été utilisé pour effectuer toutes les analyses. Style de valeur P : 0,1234 (ns), 0,0332 (*), 0,0021 (**), 0,0002 (***), < 0,0001 (****).

Les films ont été recadrés à l'aide de Fidji. Les films ont été stabilisés à l'aide du plug-in d'alignement hyperstack multicanal appelé HyperStackReg. Des annotations d'horodatage et de barre d'échelle ont été ajoutées à l'aide de Fidji. Des flèches et des pauses ont été ajoutées à l'aide d'Adobe Premier Pro.

Pour MinD et McdA, nous avons généré les modèles d'amarrage peptide-ATPase N-terminus en utilisant l'implémentation CollabFold d'AlphaFold258,59. Les peptides N-terminaux ont été définis comme les 30 premiers résidus de la protéine partenaire putative de l'extrémité N-terminale. Des alignements de séquences multiples ont été construits à l'aide de MMseqs2. Pour chaque paire peptide-ATPase, nous avons généré cinq structures avec les hyperparamètres CollabFold/AlphaFold2 par défaut enregistrés pour que le nombre de recyclages pour chaque modèle soit augmenté à 12. Par défaut pour Alphafold2, les structures ont été énergétiquement minimisées avec AMBER en utilisant le champ de force Amber99sb. Nous avons sélectionné des modèles de peptides ancrés sur la base des scores pLDDT des résidus d'interface de liaison et de la similitude avec les structures cristallines ATPase/protéine partenaire de type ParA précédemment résolues.

Pour ParA, FlhG et ParC, nous avons généré des modèles de peptides ancrés à l'aide du protocole FlexPepDock de Rosetta60. Tout d'abord, nous avons équilibré les structures d'homodimères ATPase générées à partir d'AlphaFold2 dans le champ de force ref2015_cart_cst Rosetta avec le protocole de raffinement FastRelax full-atom avec minimisation de l'espace de coordonnées cartésiennes à l'aide du minimiseur lbfgs_armijo_nonmonotone. Pour préserver la position des atomes du squelette prédite par AlphaFold2, une contrainte de coordonnées des atomes du squelette a été ajoutée. Pour cette étape initiale, nous avons généré 20 trajectoires avec la structure de notation la plus basse utilisée pour l'étape d'amarrage des peptides. Nous avons utilisé le score3 avec les champs de force docking_cen.wts_patch et REF2015 pour les étapes d'amarrage basse résolution et haute résolution du protocole FlexPepDock, respectivement. Pour chaque paire protéine/ATPase partenaire putative, nous avons simulé 50 000 trajectoires d'amarrage. Les deux mille meilleures trajectoires définies par les énergétiques les plus faibles ont ensuite été regroupées à l'aide de Calibur61. Nous avons ensuite choisi les modèles finaux basés sur les informations sur les clusters, l'énergétique et la plausibilité mécaniste. À partir des modèles ancrés finaux choisis parmi les simulations Rosetta et Alphafold2, nous avons cherché à identifier les résidus de liaison clés par le biais d'un balayage de mutation alanine in silico et de calculs ΔΔG. Nous avons muté de manière itérative tous les résidus d'interface du peptide amarré et calculé le ΔΔG en utilisant le protocole FlexDDG à Rosetta avec le champ de force talaris201462. Dans FlexDDG, pour chaque mutation, les conformations du squelette et de la chaîne latérale ont été échantillonnées 35 000 fois à l'aide de la méthode de backrub Monte Carlo de Rosetta. A chaque intervalle de 2500 échantillons, le ΔΔG de mutation a été calculé. Le ΔΔG final rapporté est la moyenne de 35 de ces trajectoires.

(Numéros d'accession NCBI : Protéine partenaire ParA (ParB)—ACX97144.1 ; Protéine partenaire MinD (MinE)—ACX96199.1; Protéine partenaire McdA (McdB)—ACX95754.1; Protéine partenaire FlhG (FliA)—ACX95566.1; Protéine partenaire ParC (CheW)—ACX95572.1). Les 30 premiers acides aminés de l'extrémité N-terminale de chaque protéine partenaire ont été ancrés sur les structures dimères in silico en utilisant AlphaFold2 (MinD, McdA) ou Rosetta (ParA, FlhG, ParC). L'interface de liaison a été définie par les résidus qui partageaient un minimum de 1 Angstrom2 de surface.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Génomes bactériens obtenus à partir de la base de données NCBI RefSeq (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/). Structures ParA/MinD ATPase déterminées expérimentalement obtenues à partir de la banque de données sur les protéines (PDB) : ParA (5U1G) ; McdA (6NOP); ParC (5U1G); MinD (3Q9L); FlhG (4RZ3). Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié et ses fichiers d'informations complémentaires. Des données sources sont également fournies avec ce document. Les données sources sont fournies avec ce document. Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié et ses fichiers d'informations complémentaires. Des données sources sont également fournies avec ce document. Les données sources sont fournies avec ce document.

Le code généré au cours de cette étude est disponible sur GitHub : Identifier les ParA/MinD ATPases dans les bactéries en utilisant BLAST (https://github.com/krthkkrv/Multiple-ParA-MinD-ATPases-coordinate-the-positioning-of-disparate-cargos-in-a-bacterial-cell)63, Identifier les déterminants de spécificité de chaque ParA/MinD ATPase dans H. neapolitanus en utilisant AlphaFold2 et Rosetta (https://github.com/jilimcaoco/Multiple-ParA-MinD-ATPases)64.

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Nous remercions Joshua S. MacCready, Christopher A. Azaldegui, Joseph L. Basalla, Ajai J. Pulianmackal et Claudia Mak pour leurs discussions approfondies. Nous remercions Holly Turula et Miles Mckenna pour leur assistance technique. Ce travail a été soutenu par le National Science Foundation Award No. 1817478 (AGV), le National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program DGE 1841052 (LTP) et des fonds d'initiation à la recherche fournis par le Département MCDB (AGV).

Département de microbiologie et d'immunologie, Université du Michigan, Ann Arbor, MI, 48109, États-Unis

Lisa T. Pulianmackal

Département de médecine computationnelle et de bioinformatique, Université du Michigan, Ann Arbor, MI, 48109, États-Unis

José Miguel I. Limcaoco et Matthew J. O'Meara

Département de biologie moléculaire, cellulaire et du développement, Université du Michigan, Ann Arbor, MI, 48109, États-Unis

Keerthikka Ravi, Sinyu Yang, Jeffrey Zhang, Mimi K. Tran, Maria Ghalmi et Anthony G. Vecchiarelli

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Conceptualisation, LTP et AGV ; Méthodologie, LTP, MJL, KR ; Analyse formelle, LTPMJL, KR, SY, MG, MJO et AGV ; Enquête, LTP, JZ et MKT ; Ressources, AGV ; Rédaction—Brouillon original, LTP et AGV ; Visualisation, LTP, JMIL, KR et AGV ; Supervision, LTP, MJO et AGV ; Financement Acquisition, LTP et AGV

Correspondance à Anthony G. Vecchiarelli.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Kai Thormann et les autres examinateurs, anonymes, pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Un dossier d'examen par les pairs est disponible.

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Réimpressions et autorisations

Pulianmackal, LT, Limcaoco, JMI, Ravi, K. et al. Plusieurs ATPases ParA/MinD coordonnent le positionnement de cargaisons disparates dans une cellule bactérienne. Nat Commun 14, 3255 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-39019-x

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Reçu : 12 janvier 2023

Accepté : 22 mai 2023

Publié: 05 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-023-39019-x

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